Аднаядзерная паслядоўнасць РНК
Тэхнічная схема
Ізаляцыя ядраў дасягаецца з дапамогай 10× Genomics Chromium™, якая складаецца з васьміканальнай мікрафлюіднай сістэмы з падвойнымі скрыжаваннямі. У гэтай сістэме шарыкі геля са штрых-кодамі і праймерам, ферменты і адно ядро інкапсулююцца ў кроплі алею памерам з наналітр, утвараючы гелевыя шарыкі ў эмульсіі (GEM). Пасля таго, як GEM сфарміраваны, лізіс клетак і вызваленне штрых-кодаў выконваюцца ў кожным GEM. мРНК адваротна транскрыбуюцца ў малекулы кДНК са штрых-кодамі 10× і UMI, якія ў далейшым падлягаюць канструкцыі стандартнай бібліятэкі секвенирования.
Асаблівасці
● Падрыхтоўка аднаядзернай завісі з замарожаных тканак
● Фарміраванне шарыка геля ў эмульсіі (GEM) з наступным сінтэзам кДНК
● Кожная пацерка ў GEM загружана праймерамі, якія складаюцца з 4 частак:
полі (dT) хвост для праймінга мРНК і сінтэзу кДНК,
Унікальны малекулярны ідэнтыфікатар (UMI) для карэкцыі зрушэння ампліфікацыі
10x штрых-код
Паслядоўнасць звязвання праймера секвенирования частковага чытання 1
Перавагі
Секвенирование аднаядзернай РНК дазваляе абыйсці абмежаванні секвенирования одноклеточной РНК, дазваляючы:
● Выкарыстанне замарожаных узораў, а не толькі свежых узораў
● Нізкі стрэс замарожаных клетак у параўнанні з ферментатыўнай апрацоўкай свежых клетак, што адлюстроўваецца ў дадзеных транскрыптому ў выглядзе генаў, выкліканых меншым стрэсам
● Няма неабходнасці ў папярэднім выдаленні эрытрацытаў
● Неабмежаваны дыяметр клеткі
● Вялікі набор узораў, якія падыходзяць для аналізу, у тым ліку складаныя і далікатныя тыпы тканін, якія схільныя да зліпання або разбурэння клетак падчас раз'яднання тканін
Узоры, якія не могуць быць прааналізаваны з дапамогай секвенирования РНК адной клеткі і прыдатныя для секвенирования РНК аднаго ядра:
| Клетка / Тканіна | Прычына |
| Несвежая замарожаная тканіна | Немагчыма атрымаць свежыя або даўно захаваныя арганізацыі |
| Цягліцавая клетка, мегакарыяцыт, тлушч… | Дыяметр ячэйкі занадта вялікі, каб увайсці ў прыбор |
| Печань… | Занадта далікатныя, каб разбіцца, не могуць адрозніць асобныя клеткі |
| Нейронавая клетка, мозг… | Больш адчувальны, лёгка стрэс, зменіць вынікі паслядоўнасці |
| Падстраўнікавая жалеза, шчытападобная жалеза… | Багаты эндагеннымі ферментамі, якія ўплываюць на выпрацоўку завісі асобных клетак |
Аднаядзерныя супраць аднаклетачных
| Аднаядзерныя | Аднаклетачны |
| Неабмежаваны дыяметр клеткі | Дыяметр клеткі: 10-40 мкм |
| Матэрыялам можа быць замарожаная тканіна | Матэрыялам павінна быць свежая тканіна |
| Нізкі стрэс замарожаных клетак | Апрацоўка ферментамі можа выклікаць стрэсавую рэакцыю клетак |
| Эрытрацыты выдаляць не трэба | Эрытрацыты неабходна выдаліць |
| Ядзерная выражае біяінфармацыю | Уся клетка выказвае біяінфармацыю |
Тэхнічныя характарыстыкі
| Узоры патрабаванняў | Бібліятэка | Стратэгія паслядоўнасці | Рэкамендаваны даныя | Кантроль якасці |
| Жывёльная тканіна ≥ 200 мг Раслінная тканіна ≥ 400 мг | Бібліятэка кДНК 10x Genomics sn | Illumina PE150 | 100K PE чытання на клетку (100-200 Гб) | 700-1200 ядраў/мкл і цэласнасць ядраў назіраецца пад мікраскопам |
Для атрымання больш падрабязнай інфармацыі аб інструкцыях па падрыхтоўцы ўзораў і працоўным працэсе абслугоўвання, калі ласка, не саромейцеся гаварыць з aBMKGENE эксперт
Працэдура абслугоўвання
Уключае наступны аналіз:
● Кантроль якасці: колькасць клетак, выяўленне генаў, дакладная ідэнтыфікацыя клетак, малекул РНК і колькасная ацэнка экспрэсіі
● Аналіз унутранага ўзору:
Кластарызацыя вочак і кластарная анатацыя
Дыферэнцыяльны аналіз выразаў: ідэнтыфікацыя DEG ў кластарах
Функцыянальная анатацыя і ўзбагачэнне кластарных DEG
● Міжгрупавы аналіз:
Спалучэнне дадзеных
Дыферэнцыяльны экспрэсійны аналіз: ідэнтыфікацыя DEG ў групах
Функцыянальнае анатаванне і ўзбагачэнне групавых ДЭГ
● Пашыраны аналіз:
Аналіз клеткавага цыклу
Аналіз псеўдачасу
Аналіз сотавай сувязі (CellPhoneDB)
Аналіз узбагачэння набору генаў (GSEA)
Аналіз унутранай выбаркі
Кластарызацыя клетак:
Дыферэнцыяльны аналіз выразаў: кластарныя DEG
Міжгрупавы аналіз
Дыферэнцыяльны аналіз выразаў: групавыя DEG
Пашыраны аналіз:
Аналіз псеўдачасу:
Аналіз клеткавага цыклу:
Азнаёмцеся з дасягненнямі, якія спрыяюць паслугі секвенирования аднаядзерных РНК BMKGene ад 10X Chromium, у гэтых публікацыях:
Ван, Л. і інш. (2021) «Аднаклетачны транскрыптамічны аналіз паказвае імунны ландшафт лёгкіх пры ўстойлівым да стэроідаў абвастрэнні астмы»,Працы Нацыянальнай акадэміі навук Злучаных Штатаў Амерыкі, 118 (2), с. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Чжэн Х. і інш. (2022) «Глабальная рэгулятарная сетка для нерэгуляванай экспрэсіі генаў і анамальнай метабалічнай перадачы сігналаў у імунных клетках у мікраасяроддзі хваробы Грейвса і тырэяідыту Хасімота»,Межы ў імуналогіі, 13, с. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Цянь, Х. і інш. (2023) «Аднаклеткавы транскрыптом выяўляе гетэрагеннасць і імунныя рэакцыі лейкацытаў пасля вакцынацыі інактываванай Edwardsiella tarda камбалы (Paralichthys olivaceus)»,Аквакультура, 566, с. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Ю, Я. і інш. (2023) «Фотадынамічная тэрапія паляпшае вынікі інгібітараў імунных кантрольных кропак шляхам рэканструкцыі супрацьпухліннага імунітэту ў пацыентаў з ракам страўніка»,Рак страўніка, 26 (5), стар. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/МЕТРЫКА.
