Геноміка чалавека
Прырода генетыка
Прачытанае паслядоўнасць ідэнтыфікуе паўторнае пашырэнне GGC у Notch2NLC, звязанае з хваробай нейрональнай інтрануклеарнай уключэння
Ont Resequencing | Illumina | Цэлая паслядоўнасць экзома | CRISPR-CAS9 ONT мэтанакіраванае паслядоўнасць | RNA-Seq | Заклік метилирования Ont 5C
Падкрэслівае
1. Аналіз сувязі на вялікай сям'і NIID былі выяўлены два звязаныя рэгіёны.
2. На аснове доўгага чытання паслядоўнасці і апасродкаванага CAS-9 узбагачэнне паслядоўнасці ONT выявіла патэнцыйную генетычную прычыну NIID, паўторнае пашырэнне GGC у 5 'UTR Notch2NLC. У гэтым даследаванні паведамлялася, што паўторнае пашырэнне ў генах, характэрных для чалавека, упершыню развівалася праз сегментарныя дубліраванні.
3.РНК -паслядоўнасць выявіла анамальныя антысэнсавыя стэнаграмы ў пачатку або ўнутры паўторных абласцей пашырэння GGC у Notch2NLC.
Фон
NЕўранальная інтрануклеарная хвароба ўключэння (NIID) - гэта прагрэсавальнае і смяротнае нейрадэгенератыўнае захворванне, якое характарызуецца наяўнасцю эазінафільнага гіаліну интрануклеарных уключэнняў у цэнтральных і перыферычных нервовых сістэмах. Яго вельмі зменныя клінічныя праявы выклікаюць вялікія цяжкасці ў дыягностыцы да ўвядзення біяпсіі скуры. Аднак метады на аснове гістапаталогіі па-ранейшаму пакутуюць ад няправільнай дыягностыкі, якая патрабуе генетычнага разумення NIID.
Дасягненні
Аналіз сувязі
SПрачытанае секвенирование на аснове цэлага генома (WGS) і цэлае паслядоўнасць Exome (WES) праводзілася на вялікай сям'і NIID (13 пацярпелых і 7 некранутых членаў). Аналіз сувязі на SNPS, здабыты з гэтых дадзеных, паказаў толькі два звязаныя рэгіёны: 3,5 Мб у 1P36.31-P36.22 (максімальны лод = 2,32) і 58,1 Мб у рэгіёне 1p22.1-q21.3 (максімальны LOD: 4.21 ). Аднак у гэтых звязаных рэгіёнах не выяўлена патагенных SNP або CNV.
GGC паўтарае пашырэнне ў Notch2NLC
NПаслядоўнасць на аснове Anopore было апрацавана на 13 пацярпелых і 4 не пацярпелых членаў з 8 сем'яў (іншы пацярпелы член быў секвенированы платформай паслядоўнасці Pacbio Long Reading.). Дадзеныя з доўгатэрміновым чытаннем выявілі захворванне, звязанае з паўторным пашырэннем GGC у 5 'UTR гена Notch2NLC, адлюстраваннем 58,1 Мб, звязанай з вобласці (мал. 1). Гэтыя паўторныя пашырэнні былі таксама выяўлены ва ўсіх 40 спарадычных выпадках NIID, выпрабаваных RP-PCR.
CДля дасягнення больш высокага пакрыцця чытання на Notch2NLC было выкарыстана мэтавая паслядоўнасць мэты на платформе Nanopore (100 x-1,795 x). Гэтыя паслядоўнасці кансенсусу добра ўзгадняліся з папярэднімі высновамі па паўторных пашырэннях GGC. Больш за тое, {(GGA) N (GGC) N} N паўтораў былі вызначаны як патэнцыяльны генетычны маркер для фенатыпу, дамінуючых слабасці (мал. 2).
Малюнак 1. Хвароба, звязанае з паўторным пашырэннем, выяўленае на экзоне 1 ізаформ Notch2NLC.
Малюнак 2. Кансенсусныя паслядоўнасці NPTCH2NLC паўтараюць у пацыентаў з NIID з (*) альбо без слабасці, дамінуючых фенатыпаў
NГены OTCH2NL-гэта спецыфічныя для чалавека гены, якія, як мяркуюць, гуляюць жыццёва важную ролю ў эвалюцыі мозгу чалавека і неўралагічных захворванняў. Аднак тры гены, звязаныя з Notch2 (Notch2nla, Notch2nlb і Notch2NLC) з> 99,1% ідэнтычнасці паслядоўнасці, не былі вырашаны да апошняй зборкі генома чалавека. Без сінтэзу і доўга чытання паслядоўнасці на нанапорнай платформе паказалі прыкметныя перавагі ў вырашэнні рэгіёнаў высокага падабенства і (GGC) N паўтараецца са 100% багатым GC.
GGC паўтарае пашырэнне ў Notch2NLC
TПаслядоўнасць Ranscriptome была апрацавана на 2 пацярпелых і 2 не пацярпелых членаў. Нармалізаваная глыбіня чытання разлічвалася на сэнсе і антысэнсальных нітках у вышэйшай частцы першага экзонаў паралогаў Notch2NL. Паталагічныя анты-сэнсавыя стэнаграмы былі знойдзены толькі ў пацярпелых выпадках, якія сядзяць у пачатку або ўнутры паўторнай вобласці пашырэння (фіялетавыя пікі ў F1-14 і F1-16 на малюнку 3.). Акрамя таго, было выяўлена 54 DEG, і ўсе былі ўзбагачаны ў тэрмінах GO і MPO, звязаныя з функцыямі нейронаў.
Малюнак 3. Нармалізаваная глыбіня чытання ў вышэйшай частцы першага экзона Notch2NLC у некранутых (вышэй) і пацярпелых (ніжэй) выпадках.
Тэхналогія
Oxford Nanopore Teghnologies (Ont)
NПаслядоўнасць Anopore адрознівае сябе ад іншых платформаў паслядоўнасці, паколькі нуклеатыды чытаюцца непасрэдна без працэсу сінтэзу ДНК. Па меры таго, як адзінкавая ДНК праходзіць праз бялковую пары нана памеру (нанапор), розныя нуклеатыды генеруюць розныя іённыя токі, якія можна захапіць і перадаць у паслядоўнасць баз. Сама платформа паслядоўнасці ONT не паказвае відавочнага тэхнічнага абмежавання на даўжыню чытання ДНК. Такім чынам, для зборкі генома высокай якасці даступныя звыш доўгімі счытваннямі (ULR). Больш за тое, гэтыя надзвычай доўгія чытанні, якія досыць доўгія, каб перасекчы складаныя функцыі паслядоўнасці або структурныя варыяцыі, дапамагаюць пераадолець абмежаванні кароткага чытання тут.
Паслядоўнасць нанапор
Ідэнтыфікацыя змены структуры (SV)
SСеквенирование без ynthesis у значнай ступені захаванай інфармацыі пра метилирование ДНК па шаблоне. Метыляваны A, T, C і G генеруюць розныя іённыя токі з не-метилированных, якія можна прачытаць непасрэдна на платформе. Паслядоўнасць нанапор дае магчымасць прафілявання цэлага генома як 5MC, так і 6mA пры дазволе з адной нуклеатыдам.
Рэкамендацыя
Jun Sone, Et. іль. Прачытанае паслядоўнасць ідэнтыфікуе паўторныя пашырэнні GGC у Notch2NLC, звязаных з хваробай нейронаў, інтрануклеарнага ўключэння. Nature Genetics (2019)
Тэхналогія і асноўныя моманты Мэта падзяліцца самым апошнім паспяховым прымяненнем розных тэхналогій паслядоўнасці высокай прапускной здольнасці на розных Arena Resement, а таксама бліскучымі ідэямі ў эксперыментальным дызайне і здабычы дадзеных.
Час паведамлення: студзень-06-2022