ТРАНСКРЫПТАМІКА
прыроды
СУВЯЗЕ
Характарыстыка поўнаметражнай стэнаграмы мутацыі SF3B1 пры хранічным лімфацытарным лейкозе паказвае зніжэнне рэгуляцыі захаваных інтронаў
Поўнафарматныя стэнаграмы| Секвеніраванне нанапор| Альтэрнатыўны аналіз ізаформы
Фон
SШырока паведамлялася, што аматычныя мутацыі ў фактары сплайсінгу SF3B1 звязаны з рознымі відамі раку, у тым ліку хранічным лімфацытарным лейкозам (ХЛЛ), увеальнай меланомай, ракам малочнай залозы і г. д. Акрамя таго, кароткія транскрыптамічныя даследаванні выявілі аберрантныя схемы сплайсінгу, выкліканыя мутацыямі SF3B1. Аднак даследаванні гэтых альтэрнатыўных мадэляў сплайсінгу доўгі час былі абмежаваныя падзейным узроўнем і адсутнасцю ведаў на ўзроўні ізаформы з-за абмежавання сабраных стэнаграм кароткага чытання. Тут была прадстаўлена платформа секвенирования нанапор для стварэння поўнаметражных транскрыптаў, што дало магчымасць даследаваць ізаформы AS.
Эксперыментальны дызайн
Эксперыменты
Групоўка:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(мутацыя K700E); 3. Нармальныя В-клеткі
Стратэгія паслядоўнасці:секвенирование бібліятэкі MinION 2D, секвенирование бібліятэкі PromethION 1D; кароткае чытанне дадзеных з тых жа ўзораў
Платформа секвенирования:АНТ Мініён; АНТ PromethION;
Біяінфарматычны аналіз
Вынікі
Ау агульнай складанасці 257 мільёнаў чытанняў былі атрыманы з 6 узораў CLL і 3 B-клетак. У сярэднім 30,5% гэтых чытанняў былі ідэнтыфікаваныя як поўнаметражныя стэнаграмы.
Fаналіз альтэрнатыўнай ізаформы РНК у даўжыні (FLAIR) быў распрацаваны для стварэння набору высоканадзейных ізаформ. FLAIR можна абагульніць наступным чынам:
Nanopore чытае выраўноўванне: вызначыць агульную структуру стэнаграмы на аснове эталоннага геному;
Sкарэкцыя злучэння злучэнняў: выпраўленне памылак паслядоўнасці (чырвоны) з сайтам злучэння альбо з анатаваных інтронаў, інтронаў з кароткачытаных дадзеных, альбо з абодвух;
Collapse: абагульніць рэпрэзентатыўныя ізаформы на аснове ланцужкоў злучэння (набор першага праходу). Выберыце высокадаверны isofrom на аснове колькасці падтрымліваючых чытанняў (парог: 3).
Малюнак 1. Аналіз FLAIR для ідэнтыфікацыі поўных ізаформ, звязаных з мутацыяй SF3B1 пры ХЛЛ
FLAIR Ідэнтыфікаваў 326 699 высоканадзейных сплайс-ізаформ, 90% з якіх з'яўляюцца новымі ізаформамі. Большасць з гэтых неанатаваных ізаформ апынуліся новымі камбінацыямі вядомых злучэнняў (142 971), у той час як астатнія новыя ізаформы ўтрымлівалі альбо захаваны інтрон (21 700), альбо новы экзон (3594).
Lпаслядоўнасці пастаяннага чытання дазваляюць ідэнтыфікаваць мутантныя SF3B1-K700E -змененыя сайты сплайсинга на ўзроўні ізаформы. Было выяўлена, што 35 альтэрнатыўных 3'SS і 10 альтэрнатыўных 5'SS былі значна дыферэнцыяльна злучаны паміж SF3B1-K700E і SF3B1-WT. 33 з 35 змяненняў былі нядаўна выяўленыя паслядоўнасцямі доўгага чытання. У дадзеных Nanopore размеркаванне адлегласці паміж SF3B1-K700E-змененымі 3'SSs да пікаў кананічных сайтаў складае каля -20 bp, што істотна адрозніваецца ад кантрольнага размеркавання, падобна таму, што паведамлялася ў паслядоўнасцях кароткага чытання CLL. Былі прааналізаваны ізаформы гена ERGIC3, дзе новая ізаформа, якая змяшчае праксімальны сайт зрошчвання, была выяўлена ў большай колькасці ў SF3B1-K700E. Як праксімальны, так і дыстальны 3'SS былі звязаны з адрознымі мадэлямі AS, якія ствараюць некалькі ізаформ.
Малюнак 2. Альтэрнатыўныя 3' схемы сплайсінгу, ідэнтыфікаваныя з дапамогай дадзеных секвенирования нанапор
Аналіз выкарыстання IR-падзей доўгі час быў абмежаваны аналізам на аснове кароткага чытання з-за ўпэўненасці ў ідэнтыфікацыі і колькаснай ацэнцы IR. Экспрэсія ІЧ-ізаформ у SF3B1-K700E і SF3B1-WT была вызначана колькасна на аснове нанапоравых паслядоўнасцей, выяўляючы глабальнае паніжэнне ІЧ-ізаформ у SF3B1-K700E.
Малюнак 4. Інтэнсіўнасць сельскай гаспадаркі і падключэнне да сеткі ў трох сельскагаспадарчых сістэмах (A і B); Выпадковы аналіз лясоў (C) і ўзаемасувязь паміж інтэнсіўнасцю земляробства і каланізацыяй AMF (D)
Малюнак 3. Падзеі арэнды Intron больш жорстка рэгулююцца ў CLL SF3B1-K700E
Тэхналогія
Нанапоравая паслядоўнасць доўгага чытання
Nсеквенирование анопор - гэта тэхналогія секвенирования электрычных сігналаў адной малекулы ў рэжыме рэальнага часу.
Dдвухцепочечная ДНК або РНК будзе звязвацца з нанапорістым бялком, убудаваным у біяплёнку і раскручвацца пад кіраўніцтвам рухальнага бялку.
DНіткі NA / РНК праходзяць праз бялковы канал нанапор з пэўнай хуткасцю пад дзеяннем рознасці напружання.
Mмалекулы генеруюць розныя электрычныя сігналы ў залежнасці ад хімічнай структуры.
Rпастаяннае выяўленне паслядоўнасцей дасягаецца базавым выклікам.
Выкананне поўнаметражнага секвенирования транскриптомов
√ Насычанасць дадзенымі
Для дасягнення супастаўнай насычанасці дадзенымі патрабуецца ў 7 разоў менш чытанняў.
√ Ідэнтыфікацыя структуры стэнаграмы
Ідэнтыфікацыя разнастайных структурных варыянтаў з кансенсусным поўнаметражным чытаннем кожнай стэнаграмы
√ дыферэнцыяльны аналіз на ўзроўні стэнаграмы - выявіць змены, схаваныя кароткімі чытаннямі
Даведка
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV і інш. Характарыстыка поўнаметражнага стэнаграмы мутацыі SF3B1 пры хранічным лімфацытарным лейкозе выяўляе зніжэнне рэгуляцыі захаваных інтронаў [J]. Камунікацыі прыроды.
Тэхналогія і асноўныя моманты імкнецца падзяліцца самымі апошнімі паспяховым прымяненнем розных высокапрадукцыйных тэхналогій секвеніравання на розных даследчых арэнах, а таксама бліскучымі ідэямі ў галіне распрацоўкі эксперыментаў і аналізу даных.
Час публікацыі: 8 студзеня 2022 г