Enkelkern-RNA-volgordebepaling
Tegniese Skema
Die isolasie van kerne word bewerkstellig deur 10× Genomics Chromium™, wat bestaan uit agt-kanaal mikrofluïdiese stelsel met dubbele kruisings. In hierdie stelsel word 'n jelkrale met strepieskodes en onderlaag, ensieme en 'n enkele kern in 'n nanoliter-grootte oliedruppel ingekapsuleer, wat Gel Bead-in-Emulsion (GEM) genereer. Sodra GEM gevorm is, word sellise en vrystelling van strepieskodes in elke GEM uitgevoer. mRNA word omgekeerd getranskribeer in cDNA-molekules met 10× strepieskodes en UMI, wat verder onderhewig is aan standaardvolgorde-biblioteekkonstruksie.
Kenmerke
● Voorbereiding van enkelkerne-suspensie uit bevrore weefsels
● Vorming van Gel Bead-in-Emulsion (GEM) gevolg deur cDNA-sintese
● Elke kraal in 'n GEM is gelaai met onderlaag wat uit 4 afdelings bestaan:
poli(dT) stert vir mRNA-priming en cDNA-sintese,
Unieke Molekulêre Identifiseerder (UMI) om amplifikasie-vooroordeel reg te stel
10x strepieskode
Bindingsvolgorde van gedeeltelike lees 1 volgordebepaling primer
Voordele
Enkelkern-RNA-volgordebepaling omseil die beperkings van enkelsel-RNA-volgordebepaling, wat die volgende moontlik maak:
● Die gebruik van bevrore monsters en nie net beperk tot vars monsters nie
● Lae stres van bevrore selle in vergelyking met ensiematiese behandeling van vars selle, weerspieël in die transkripsiedata in die vorm van minder stresgeïnduseerde gene
● Dit is nie nodig om rooibloedselle vooraf te verwyder nie
● Onbeperkte sel deursnee
● Groot verskeidenheid monsters wat vir ontleding in aanmerking kom, insluitend komplekse en brose weefseltipes wat geneig is tot selklomp of vernietiging tydens weefseldissosiasie
Monsters wat nie deur enkelsel-RNA-volgordebepaling ontleed kan word nie en kom in aanmerking vir enkelkern-RNA-volgordebepaling:
| Sel / Weefsel | Rede |
| Onvars bevrore weefsel | Kan nie vars of organisasies wat lank gered is, kry nie |
| Spiersel, Megakariosiet, Vet... | Seldeursnee is te groot om die instrument binne te gaan |
| Lewer… | Te broos om te breek, nie in staat om enkelselle te onderskei nie |
| Neuronsel, brein... | Meer sensitief, maklik om te beklemtoon, sal die volgorde resultate verander |
| Pankreas, Skildklier … | Ryk aan endogene ensieme, wat die produksie van enkelselsuspensie beïnvloed |
Enkelkern vs Enkelsel
| Enkelkern | Enkelsel |
| Onbeperkte sel deursnee | Seldeursnee: 10-40 μm |
| Die materiaal kan bevrore weefsel wees | Die materiaal moet vars weefsel wees |
| Lae stres van bevrore selle | Ensiembehandeling kan selstresreaksies veroorsaak |
| Geen rooibloedselle hoef verwyder te word nie | Rooibloedselle moet verwyder word |
| Kern druk bio-inligting uit | Die hele sel druk bio-inligting uit |
Spesifikasies
| Voorbeeldvereistes | Biblioteek | Opeenvolgingstrategie | Data aanbeveel | Gehaltebeheer |
| Diereweefsel ≥ 200 mg Plantweefsel ≥ 400 mg | 10x Genomics sn cDNA-biblioteek | Illumina PE150 | 100K PE-lesings per sel (100-200 Gb) | 700-1200 kerne/μl en kerne-integriteit waargeneem onder mikroskoop |
Vir meer besonderhede oor voorbeeldvoorbereidingsleiding en dienswerkvloei, praat gerus met aBMKGENE deskundige
Dienswerkvloei
Sluit die volgende ontleding in:
● Kwaliteitbeheer: aantal selle, geenopsporing, akkurate identifikasie van selle, RNA-molekules en uitdrukkingskwantifisering
● Innerlike monsterontleding:
Selgroepering en trosaantekening
Differensiële uitdrukkingsanalise: identifikasie van DEG's in trosse
Funksionele annotasie en verryking van cluster DEG's
● Intergroep-analise:
Kombinasie van data
Differensiële uitdrukkingsanalise: identifikasie van DEG's in groepe
Funksionele annotasie en verryking van groep DEG's
● Gevorderde analise:
Selsiklusanalise
Pseudotyd analise
Selkommunikasie-analise (CellPhoneDB)
Geneset-verrykingsanalise (GSEA)
Binne-steekproef analise
Selgroepering:
Differensiële uitdrukkingsanalise: groep DEG's
Intergroepanalise
Differensiële uitdrukkingsanalise: Groep DEG's
Gevorderde analise:
Pseudotyd analise:
Selsiklusanalise:
Verken die vooruitgang wat deur BMKGene se enkelkern-RNA-volgordebepalingsdienste deur 10X Chromium gefasiliteer word in hierdie uitgesproke publikasies:
Wang, L. et al. (2021) 'Enkel-sel transkriptomiese analise onthul die immuunlandskap van longe in steroïed-weerstandige asma-verergering',Verrigtinge van die Nasionale Akademie van Wetenskappe van die Verenigde State van Amerika, 118(2), bl. e2005590118. doi: 10.1073/pnas.2005590118
Zheng, H. et al. (2022) ''n Wêreldwye regulatoriese netwerk vir wanreguleerde geenuitdrukking en abnormale metaboliese sein in immuunselle in die mikro-omgewing van Graves se siekte en Hashimoto se tiroïeditis',Grense in Immunologie, 13, bl. 879824. doi: 10.3389/FIMMU.2022.879824/BIBTEX.
Tian, H. et al. (2023) 'Eenseltranskriptoom ontbloot heterogeniteit en immuunresponse van leukosiete na inenting met geïnaktiveerde Edwardsiella tarda in bot (Paralichthys olivaceus)',Akwakultuur, 566, bl. 739238. doi: 10.1016/J.AQUACULTURE.2023.739238.
Yu, Y. et al. (2023) 'Fotodinamiese terapie verbeter die uitkoms van immuunkontrolepunt-inhibeerders deur hermodellering van anti-tumor-immuniteit by pasiënte met maagkanker',Maagkanker, 26(5), pp. 798–813. doi: 10.1007/S10120-023-01409-X/METRICS.
