Menslike genomika
Natuurgenetika
Langlees opeenvolging identifiseer GGC-herhaalde uitbreidings in Notch2NLC wat verband hou met neuronale intranukleêre insluiting siekte
Onte -restequencing | Illumina | Hele eksoomvolgorde | CRISPR-CAS9 ONT geteikende volgorde | RNA-seq | ONT 5MC metieleringoproep
Hoogtepunte
1. By skakelanalise Op 'n groot NIID -familie is twee gekoppelde streke geïdentifiseer.
2. On-gebaseerde langlees opeenvolging en CAS-9-bemiddelde verryking ONT-volgorde het 'n moontlike genetiese oorsaak van NIID, GGC herhaalde uitbreidings in 5 ′ UTR van Notch2NLC ontdek. Hierdie studie het vir die eerste keer herhaalde uitbreidings in mensspesifieke gene gerapporteer wat ontwikkel het deur segmentele duplikasies.
3.RNA -volgorde het abnormale antisense -transkripsies in die begin of binne GGC herhaalde uitbreidingsgebiede in Notch2NLC geopenbaar.
Agtergrond
NEuronale intranukleêre insluiting siekte (NIID) is 'n progressiewe en dodelike neurodegeneratiewe siekte, wat gekenmerk word deur die teenwoordigheid van eosinofiele hyalien -intranukleêre insluitings in sentrale en perifere senuweestelsels. Die hoogs veranderlike kliniese manifestasies wek groot probleme in die diagnose tot die bekendstelling van velbiopsie. Histopatologie-gebaseerde metodes ly egter steeds aan verkeerde diagnose, wat 'n genetiese begrip van NIID vra.
Prestasies
Skakelanalise
SHort-lees-volgorde-gebaseerde geheelgenoomvolgorde (WGS) en die hele eksoomvolgorde (WES) is uitgevoer op 'n groot NIID-familie (13 geraak en 7 lede wat nie geraak is nie). Skakelanalise op SNP's wat uit hierdie data onttrek is, het slegs twee gekoppelde streke aan die lig gebring: 'n 3,5 Mb-streek by 1P36.31-P36.22 (maksimum LOD = 2.32) en 'n 58.1 MB-streek by 1p22.1-Q21.3 (maksimum LOD: 4.21 ). Geen patogene SNP's of CNV's is egter in hierdie gekoppelde streke geïdentifiseer nie.
GGC herhaal uitbreidings in Notch2NLC
NAnopore-gebaseerde opeenvolging is verwerk op 13 lede wat nie geraak is nie en 4 onaangeraakte lede uit 8 gesinne ('n ander lid wat geraak is, is deur Pacbio Long Read Sequencing Platform opeenvolgend.) Langgeleesde data het die siekte geassosieerde GGC herhaalde uitbreidings in die 5 ′ UTR van Notch2NLC-geenkartering tot 58,1 Mb gekoppelde streek (Figuur 1). Hierdie herhaalde uitbreidings is ook geïdentifiseer in al 40 sporadiese NIID-gevalle wat deur RP-PCR getoets is.
CAS-9-gemedieerde teikenvolgorde op die nanopore-platform is gebruik om hoër leesdekking te bereik oor die Notch2NLC-herhaling (100 x-1,795 x). Hierdie konsensusreekse het goed saamgestem met vorige bevindings oor GGC -herhaalde uitbreidings. Boonop is {(gga) n (ggc) n} n herhalings geïdentifiseer as 'n potensiële genetiese merker vir swakheid-dominante fenotipe (Figuur 2).
Figuur 1. Siekte geassosieerde herhaalde uitbreiding geïdentifiseer op exon 1 van Notch2NLC isoforme.
Figuur 2. Konsensusvolgordes van NPTCH2NLC herhaal by NIID-pasiënte met (*) of sonder swakheid-dominante fenotipe
NOTCH2NL-gene is mensspesifieke gene, wat glo 'n belangrike rol speel in die evolusie van die menslike brein en neurologiese siektes. Drie Notch2 -verwante gene (Notch2NLA, Notch2NLB en Notch2NLC) met> 99,1% volgorde -identiteit is egter eers opgelos tot die jongste menslike genoomvergadering. Sintese-vrye en langlees-volgorde op nanopore-platform het noemenswaardige voordele getoon in die oplossing van streke met 'n hoë ooreenkoms en (GGC) N herhalings met 100% GC-ryk.
GGC herhaal uitbreidings in Notch2NLC
TRanscriptome volgorde is verwerk op 2 lede wat geraak word en 2 nie beïnvloed nie. Normaliseerde leesdiepte is bereken op sin- en antisense -stringe in die stroomop van eerste eksone van Notch2NL -paralogs. Abnormale anti-sintranskripsies is slegs gevind in gevalle wat aangetas is, wat in die begin of binne die herhaalde uitbreidingsgebied sit (pers pieke in F1-14 en F1-16 in Figuur 3.). Daarbenewens is 54 degs geïdentifiseer en almal is verryk in GO- en MPO -terme wat verband hou met neuronale funksies.
Figuur 3. Normaliseerde leesdiepte op stroomop van die eerste ekson van Notch2NLC in onaangeraak (hierbo) en geaffekteerde (onder) gevalle.
Tegnologie
Oxford Nanopore Teghnologies (Ont)
NAnopore -volgorde onderskei hom van ander volgorde -platforms, deurdat die nukleotiede direk gelees word sonder DNA -sintese -proses. Aangesien 'n enkele string DNA deur 'n nano-grootte proteïenpore (nanopore) beweeg, genereer verskillende nukleotiede verskillende ioniese strome, wat vasgelê en oorgedra kan word in die volgorde van basisse. Die ONT -volgorde -platform self toon nie 'n oënskynlike tegniese limiet op die lengte van die DNA -lesing nie. Daarom is ultra-lange lesings (ULR's) beskikbaar vir die genoom-samestelling van hoë gehalte. Boonop help hierdie buitengewone lang lesings, wat lank genoeg is om komplekse volgorde-funksies of strukturele variasie te kruis, die beperkings van kortlees-volgorde hier oorkom.
Nanopore volgorde
Struktuurvariasie (SV) identifikasie
SYnthesis-vrye opeenvolging van grootliks bewaarde DNA-metieleringinligting op die sjabloon. Gemetileerde A, T, C en G genereer verskillende ioniese strome van on-gemetileerde, wat direk op die platform gelees kan word. Nanopore-opeenvolging bemagtig die hele genoomprofiel van beide 5MC en 6MA by enkel-nukleotiedoplossing.
Getuigskrif
Jun Sone, et. al. Langlees opeenvolging identifiseer GGC-herhaalde uitbreidings in Notch2NLC wat verband hou met neuronale intranukleêre insluiting siekte. Nature Genetics (2019)
Tegnologie en hoogtepunte Die doel om die mees onlangse suksesvolle toepassing van verskillende opeenvolgingstegnologieë met 'n hoë deurvoer te deel, in verskillende reek-arena, sowel as briljante idees in eksperimentele ontwerp en data-ontginning.
Postyd: Jan-06-2022