Transkriptomika
natuur
Kommunikasie
Volledige transkripsie-karakterisering van SF3B1-mutasie in chroniese limfositiese leukemie onthul afregulering van behoue introns
Vollengte transkripsies | Nanopore -volgorde | Alternatiewe isoformanalise
Agtergrond
SDaar is wyd berig dat omatic mutasies in splitsingsfaktor SF3B1 met verskillende kankers geassosieer word, waaronder chroniese limfositiese leukemie (CLL), uveal melanoom, borskanker, ens. Studies oor hierdie alternatiewe splitsingspatrone is egter lank beperk tot gebeurtenisvlak en 'n gebrek aan kennis op isoformvlak as gevolg van die beperking van kortlees saamgestelde transkripsies. Hier is die nanopore-volgorde-platform bekendgestel om transkripsies in vollengte te genereer, wat die invordering van as isoforme bemagtig het.
Eksperimentele ontwerp
Eksperimente
Groepering:1. CLL-SF3B1 (WT) 2. CLL-SF3B1 (K700E-mutasie); 3. Normale B-selle
Volgorde -strategie:Minion 2D -biblioteekvolgorde, Promethion 1D -biblioteekvolgorde; Kort leesdata van dieselfde monsters
Volgorde -platform:Ont Minion; Ont Promethion;
Bioinformatiese analise
Resultate
NTotaal van 257 miljoen lesings is gegenereer uit 6 CLL-monsters en 3 B-selle. Gemiddeld 30,5% van hierdie lesings is as vollengte transkripsies geïdentifiseer.
FULL-lengte alternatiewe isoformanalise van RNA (FLAIR) is ontwikkel om 'n stel hoëvertroue-isoforme te genereer. Flair kan saamgevat word as:
NAnopore lees belyning: identifiseer algemene transkripstruktuur gebaseer op die verwysingsgenoom;
SPlice-aansluitingskorreksie: Korrekte volgorde-foute (rooi) met 'n splitsingsplek van óf geannoteerde introns, introns van kort leesdata of albei;
COLLAPSE: Som 'n verteenwoordigende isoforme op gebaseer op splitsverbindingskettings (eerste-pas-stel). Kies isofrom met 'n hoë vertroue gebaseer op die aantal ondersteunende lesings (drempel: 3).
Figuur 1. FLAIR-analise om volle-lenth isoforme te identifiseer wat verband hou met SF3B1-mutasie in CLL
FLair het 326.699 hoëvertroue isoforme geïdentifiseer, waarvan 90% nuwe isoforme is. Daar is gevind dat die meeste van hierdie onaangewese isoforme nuwe kombinasies van bekende splitsmonke (142.971) was, terwyl die res -roman isoforme óf behoue intron (21,700) óf 'n nuwe ekson (3594) bevat.
LONG-leesvolgordes bemagtig die identifisering van mutante SF3B1-K700E-verwante splitsingsplekke op isoformvlak. 35 Alternatiewe 3'sss en 10 alternatiewe 5'SS's is beduidend onderskei tussen SF3B1-K700E en SF3B1-WT. 33 van die 35 veranderings is nuut ontdek deur langlees rye. In nanopore-gegewens is die verdeling van die afstand tussen SF3B1-K700E-veranderde 3'SSS na kanonieke terreine ongeveer -20 pk, wat aansienlik verskil van 'n kontroleverspreiding, soortgelyk aan wat in CLL-kortleesreekse gerapporteer is. Isoforme van ERGIC3-geen is geanaliseer, waar 'n nuwe isoform wat die proksimale spleetplek bevat, meer volop in SF3B1-K700E gevind is. Beide proksimale en distale 3's is geassosieer met gedistreerde as patrone wat veelvuldige isoforme opwek.
Figuur 2. Alternatief 3 ′ Splytpatrone geïdentifiseer met nanopore -volgorde -data
IR-ontleding van gebeurtenisgebruik is lank beperk in kortlees-gebaseerde analise as gevolg van vertroue in IR-identifikasie en kwantifisering. Die uitdrukking van IR-isoforme in SF3B1-K700E en SF3B1-WT is gekwantifiseer op grond van nanopore-reekse, wat 'n wêreldwye af-regulering van IR-isoforme in SF3B1-K700E onthul.
Figuur 4. Landbouintensiteit en netwerkverbinding oor drie boerderystelsels (A en B); Willekeurige bosanalise (C) en die verband tussen landbouintensiteit en AMF -kolonisasie (D)
Figuur 3. Intron-huurgebeurtenisse word sterker gereguleer in CLL SF3B1-K700E
Tegnologie
Nanopore langlees volgorde
NAnopore-volgorde is 'n enkele molekule real-time elektriese seinvolgorde-tegnologie.
DOulble-gestrand DNA of RNA sal bind aan nanoporeuse proteïen wat in die biofilm ingebed is en onder die lood van motoriese proteïen ontspan.
DNa/RNA -stringe gaan deur die nanopore -kanaalproteïen teen 'n sekere tempo onder die werking van die spanningsverskil.
MOlecules genereer verskillende elektriese seine volgens die chemiese struktuur.
REAL-tyd-opsporing van reekse word bereik deur basisoproepe.
Prestasie van vollengte transkriptome volgorde
√ Dataversadiging
7-vou minder leesstukke wat benodig word om vergelykbare dataversadiging te bereik.
√ Transkripstruktuuridentifikasie
Identifisering van verskillende strukturele variante met konsensus vollengte-uitlees van elke transkripsie
√ Transkriptevlak Differensiële analise-Ontbindingveranderings verborge deur kortlees
Getuigskrif
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al. Volledige transkripsie-karakterisering van SF3B1-mutasie in chroniese limfositiese leukemie onthul afregulering van behoue introns [J]. Natuurkommunikasie.
Tegnologie en hoogtepunte Die doel om die mees onlangse suksesvolle toepassing van verskillende opeenvolgingstegnologieë met 'n hoë deurvoer te deel, in verskillende reek-arena, sowel as briljante idees in eksperimentele ontwerp en data-ontginning.
Postyd: Jan-08-2022